色譜定量方法
                                                             上海連橋生物科技有限公司

面積歸一法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法。這么多定量法，用哪一種呢？每一種的適用范圍是什么呢？其優(yōu)缺點(diǎn)又是什么？其標(biāo)準(zhǔn)物又有什么要求呢？看完你就都知道了。

歸一化法

把所有出峰的組分含量之和按100%計(jì)的定量方法，稱為歸一化法。

各成分校正因子一致時(shí)可用該法，該法簡便、準(zhǔn)確，特別是進(jìn)樣量不容易準(zhǔn)確控制時(shí)，進(jìn)樣濃度及進(jìn)樣量的變化的影響很小。

其他操作條件，如流速、柱溫等變化對定量結(jié)果的影響也很小。GC應(yīng)用廣于HPLC。

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法、直接比較法）

首先用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對校正因子。

當(dāng)欲測組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時(shí)，也可以不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，而用單點(diǎn)校正法，即直接比較法定量。單點(diǎn)校正法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的另一個(gè)點(diǎn)。因此，當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差時(shí)（即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)），單點(diǎn)校正法的誤差較大。因此規(guī)定，y=ax+b 。b的絕對值應(yīng)不大于100%響應(yīng)值是y的2%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測定工作就很簡單了，計(jì)算時(shí)可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，這對大量樣品分析十分合適。特別是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制后可以使用一段時(shí)間，在此段時(shí)間內(nèi)可經(jīng)常用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品對標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行單點(diǎn)校正，以確定該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是否還可使用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能，柱溫度，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難*相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進(jìn)行補(bǔ)償。

內(nèi)標(biāo)法

選擇適宜的物質(zhì)作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進(jìn)行定量分析的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。

內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與欲測組分相近，不與被測樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)要能*溶于被測樣品中。內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近欲測組分的峰，或位于幾個(gè)欲測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即*分開。一般會選擇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的同位素物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物。

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量的變化，色譜條件的微小變化對內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標(biāo)物，然后再進(jìn)行前處理時(shí)，可部分補(bǔ)償欲測組分在樣品前處理時(shí)的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時(shí)，可以加入數(shù)種內(nèi)標(biāo)物，以提高定量分析的精度。

內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難，內(nèi)標(biāo)物的稱量要準(zhǔn)確，操作較麻煩。使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)要測量欲測組分和內(nèi)標(biāo)物的兩個(gè)峰的峰面積（或峰高），根據(jù)誤差疊加原理，內(nèi)標(biāo)法定量的誤差中，由于峰面積測量引起的誤差是標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的2-2，但是由于進(jìn)樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內(nèi)標(biāo)法比標(biāo)準(zhǔn)曲線法要小很多，所以總的來說，內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。

標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí)，以欲測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質(zhì)前后欲測組分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算欲測組分在樣品中的含量的方法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法的優(yōu)點(diǎn)：不需要另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，只需欲測組分的純物質(zhì)，進(jìn)樣量不必十分準(zhǔn)確，操作簡單。若在樣品的前處理之前就加入已知準(zhǔn)確量的欲測組分，則可以*補(bǔ)償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法的缺點(diǎn)：要求加入欲測組分前后兩次色譜測定的色譜條件*相同，以保證兩次測定時(shí)的校正因子*相等，否則將引起分析測定的誤差。

本篇轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)之家